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          三代全长转录组测序

            


          三代全长转录组测序

           

          SMRT测序的全称是Single Molecule, Real-Time Sequencing,即单分子实时测序,是PacBio推出的一项专利技术。顾名思义,SMRT技术核心就是能够实现单个DNA分子的测序,并且实时监控测序结果。

          原理:SMRT测序采用四色荧光标记的dNTP和ZMW孔完成对单个DNA分子的测序。每个ZMW孔中,单个DNA分子模板与引物结合,然后结合DNA聚合酶后,被固定到ZMW孔底部。加入四色荧光标记的dNTP后,DNA合成开始,受碱基配对原则支配,连接上的dNTP会由于碱基配对在ZMW底部停留较长时间,激发后发出对应的荧光信号被识别,返回的荧光信号会形成一个特殊的脉冲波。

          另一方面由于荧光信号连接在dNTP的磷酸基团上,当上一个dNTP合成后,磷酸基团自动脱落,保证了检测的连续性,提高了检测速度,每秒钟合成3个碱基的速度,配上高分辨率的光学检测系统,实现实时检测。



           

           

          技术流程

           

          文库构建流程

          PacBio Sequel系统使用的全长转录组建库有SMARTer?和SuperScript?两种方式

          经过对仪器和试剂的调试,欧易使用效率更高的Clontech公司的SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit进行建库

          相比前代RS系列测序仪,Sequel系统在SMRT Cell片段长度偏好性方面已经有很大改进,4 kb以下的建库无需进行片段大小选择


          SMARTer?文库构建示意图

            


          分析流程

          Sequel数据分析流程示意图

            



           

            


          分析内容

           

          Iso-seq分析包含4个主要的步骤,分别是CCS,Classify,Cluster和Subset(可?。?/span>


          Iso-seq分析示意图

           

          CCS步骤:该步骤主要基于来自同一条Polymerase Read中的Subreads序列构建CCS序列。

          Classify步骤:该步骤通过分析CCS序列,输出两个文件。一个文件包含全长非嵌合体序列(Full-length Non-chimeric Reads)和非全长序列。

          在该过程中,Classify步骤会去除CCS序列中包含的PolyA/T Tails和Primer序列,去除污染序列,但是会保留PCR引起的嵌合体序列。

          Cluster步骤:该步骤基于全长非嵌合体序列和非全长序列,进行质量校正处理,生成Polished高质量的一致性序列和低质量一致性序列。

          Subset步骤:这是一个可选步骤,主要用于从输出文件中将指定类型的序列输出出来,比如非嵌合体Reads等。

           

           

          根据测序样本对应参考基因组的有无,会有分析内容上的差异

          如果进行三代全长转录组测序的同一批样本有二代转录组测序的数据(或同时进行二代转录组测序)

          则可以将二、三代转录组测序的数据结合进行分析,增加表达差异信息 

          欧易公司最近对分析流程进行升级,无参全长转录组测序也能够进行可变剪接分析

           

           

          备注:本页面提及的专利技术,指的是本公司采购的设备生产商PacBio所拥有的发明专利,与本公司产品或技术方法无关。相关技术专利号为WO2006083751、WO2007019582、WO2007041342、US2007206187、US9200320B2,受世界知识产权组织(Would Intellectual Property Organization,WIPO)、PCT(专利合作条约)条约等?;?。

           

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