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          4D-PRM靶向蛋白质组学



          4D-PRM技术

           

          4D-PRM方法在传统蛋白组学中引入第四个维度——离子淌度,突破过去靶向组学的最大限制,在不牺牲检测灵敏度、扫描速度及选择性且单针靶向离子数最大化的前提下,展现高度重现性及准确定量,带领靶向蛋白组学突破研究瓶颈、进入新高度。

          PRM-PASEF这种模式利用了Tims进行第四维度分离,相对于普通的PRM提高了多肽离子的选择性和灵敏度,并结合了PASEF的高扫描速度从而增加了靶标离子的数量,实现更多、更快、更准确的靶向蛋白组检测,为靶向蛋白质组学在大队列中的应用带来无限可能。


          4D-PRM蛋白组学

          △ PRM示意图






          技术优势

           


          4D-PRM更高的验证通量


          基于TimsTOF Pro开发的4D-PRM在60分钟的色谱梯度实现100个差异蛋白的验证,相比较于3D-PRM验证通量在色谱梯度减少1/3的时间上蛋白数提高了2倍以上。这得益于TimsTOF Pro大于120Hz的MS/MS扫描速度,PRM-PASEF理论上每100ms的Tims ramp time可靶向大于12个目标离子,在1s的duty cycle时间内则可靶向超过100个目标离子,使得PRM-PASEF能够在短时间内定量到更多蛋白(下图)。


          4D-PRM蛋白组学


          △ PRM-PASEF采集Cycle示意图



          下图显示是我们在做PRM预扫得到的时间窗口图,在100个蛋白(300条肽段)做4D-PRM验证,10分钟窗口并行的肽段数50条,TimsTOF Pro的扫描速度远远满足检测需求。


          4D-PRM蛋白组学

          △ 扫描时间窗口设定


           




          4D-PRM更高的离子选择性


          4D-PRM的采集窗口包含色谱保留时间、离子淌度与四极杆隔离质荷比三个维度,在TimsTOF Pro上,当存在保留时间及质荷比相同的母离子时,仍可以通过离子淌度这一维度进行分离,增加谱图专一性及定量准确性。下图所示即在未开启离子淌度时,谱图存在明显的杂峰,当开启时谱图排除了相关离子干扰增加了谱图的选择性也使定量更为准确。

          4D-PRM蛋白组学

          △ 离子淌度过滤窗口可显著降低目标离子的背景 






          4D-PRM具有高度重现性及精准定量


          PASEF快速的扫描能力能得到更多的数据采集点,产生专属性更高的MS/MS谱图,极大提高检测灵敏度和定量可靠性。鹿明内测数据中iRT标准肽段在所有样本中的保留时间非常稳定,说明定性准确(下图)。


          4D-PRM蛋白组学

          △  iRT内标肽段保留时间分布


          示例肽段GTFIIDPGGVIR的峰图(不同颜色曲线代表肽段对应的二级碎片(b,y离子),同一肽段的所有b,y离子定量值的加和即认为是该肽段的定量值)和峰面积比较图均显示定量准确度极高,统计分析发现iRT肽段各重复之间变异系数均小于20%,说明4D-PRM重复测试之间定量稳定性良好,系统误差较小。



          4D-PRM蛋白组学

          △  GTFIIDPGGVIR峰图


          4D-PRM蛋白组学

          △  GTFIIDPGGVIR峰面积


          4D-PRM蛋白组学

          △  iRT肽段重复定量之间的变异系数







          实验流程



          4D-PRM蛋白组学






          应用领域



          验证组学结果

          验证差异蛋白、确证突变位点、确认修饰位点等



          生物标志物

          标志物筛选、验证、绝对定量等



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